grna在线设计-【手把手教你发高分文章】5步法教你构建KO细胞系

我对之前的所有教程进行了再次详细的总结

CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计(上)

在上一次文章中,我们已经得到了在线工具设计的sgRNA序列,经由简单评估后选择出合适的sgRNA

以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 为案例,根据给出的PTEN sgRNA,完善oligo序列,并再Snapgene软件中匹配出来

使用Snapgene一键生成oligo,Actions--Anneal Oligos

粘贴事先准备好的序列--保存Oligo文件

(1)打开一个pSpCas9质粒--actin--restriction cloning--insert fragment

(2)在Vector选项卡,选择内切酶为BbsI,在insert部分选择上一步中保存好的oligo,最后点击clone,保存DNA文件。

(3)打开插入后的质粒图谱,检查oligo插入情况,无误后可提交上表中的

这里检测所用的引物和平时做PCR检测mRNA表达的引物是不同的,这里的PCR产物必须覆盖基因编辑的位置,且产物要足够长,至少500 bp。在这里我们以P53为例子:

(1)找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列(2000 bp)

(2)将找到的序列复制粘贴到blast中

设置参数

(3)得到结果(小测试,为何得到的引物只有两对,而且似乎有一对还偏离中心很远,请问应该如何设置,使得产物聚集在中心?)

(4)查看引物基本情况,检查无误可提交公司合成

结语:

以上,我们则是完成了sgRNA及引物设计,提交公司合成,拿到之后则可开始正式实验了,感兴趣的同学,可以完成上面的小测试,有问题请在下方留言,拜拜~

CRISPR/Cas9技术可以让目的基因产生功能性缺失突变,并由此改变了科学家研究目的基因的方式。利用CRISPR/Cas9技术在单个细胞上产生一个突变来建立一个新的细胞系,也就是CRISPR介导的基因敲除克隆。这些克隆细胞系是探索蛋白质功能、分析敲除基因后的结果和研究生物试剂特异性的重要工具。然而,想要成功获取到敲除克隆,在技术上是具有一定挑战性的。在实践中,做一个基因敲除克隆并不是那么简单的。想要获得高质量和可复制的编辑细胞可能需要一定的经验和技术优化。

CRISPR基因敲除细胞株 的标准工作流程,涵盖从项目设计方案到单克隆验证的五个主要步骤:

1. 设计基因敲除方案并制备 敲除载体

2. 细胞转染

3. KO细胞的扩增

4. 挑单克隆细胞并扩增

5. KO验证

可想而知这个过程中会涉及到许多不同实验方法和技术,因此上述的每一步都是需要你仔细考虑并且对你的实验经验与技术操作都有较高的要求,你做好全面地学习构建 KO细胞系 的准备了吗?

如何设计和构建gRNA:

gRNA可以识别靶基因区域并将Cas9引导至DNA的靶部分。对于gRNA的制作,需要设计和合成gRNA寡核苷酸序列。然后将合成的寡核苷酸克隆到合适的表达载体中并验证寡核苷酸序列。

研究人员可以用几种不同的形式去构建 敲除细胞株 ,如单gRNA,双oligo系统的cr:tracrRNA,体外转录 RNA,质粒和 慢病毒 。 其中,基于质粒和慢病毒的方法是最受研究人员欢迎的。但是它们耗时、需要进行筛选,并且有可能导致脱靶。但慢病毒对一些难以转染的细胞有着显著优势。此外,使用多个gRNA可以增加编辑成功的几率,并在挑克隆阶段节省下游时间。但前提是这些gRNA必须是要正确靶向靶位点的。构建敲除细胞株,首先要设计靶向目的基因的gRNA,gRNA需要克隆到合适的表达载体中并进行gRNA的序列验证。

事实上,设计gRNA需要考虑的因素比较多,对于操作者的专业能力与实验经验都有较高的要求,如果你对自己设计的gRNA没有足够的信息,可以考虑使用一些gRNA设计工具,比如 红棉系统-CRISPR基因编辑设计工具 ,它是可用于在线设计敲除细胞株方案和gRNA的免费工具。 其中包含了800多个细胞系的参数,并结合了源井生物领先的gRNA设计原理。您只需要输入目的基因,就可以得到3种不同的敲除方案。同时,红棉系统有一个gRNA载体库,其中有在实验中被成功验证过的gRNA, 其中超过10000个用于构建敲除细胞株的gRNA载体。

确定了CRISPR敲除方案之后,下一步就是选择最有效的细胞转染方法。许多研究人员认为选出最有效的转染方法是CRISPR工作流程中最困难的一步。每种细胞类型通常需要不断优化,调整转染条件以准确地将CRISPR基因编辑载体递送到细胞中。除此之外,一些细胞类型,包括干细胞,原代细胞和免疫和造血细胞谱系更难以转染,因为它们改变了细胞修复机制,降低了细胞活力。因此, 想要成功转染的前提就是对目的细胞系的经验以了解细胞特征。

源井生物已经成功编辑超过200种细胞系,并开发了一个成熟的操作体系来探索针对不同细胞系的最佳转染方法,我们领先的技术以及丰富的实验经验让我们的 KO细胞服务 值得每一位研究工作者给予信赖!

挑单克隆 被认为是选取一个匀质、单一的含有所需基因敲除的细胞团的最佳方法。 研究人员通常使用两种常用的挑单克隆和扩增方法,一种是用极限稀释法来挑单克隆,另一种是单细胞荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS)。 尽管两种方法都可以达到挑单克隆和扩增的目的,鉴于FACS分选得特异性分离双阳性细胞的能力,FACS通常更有效。然而,极限稀释法比分选更便宜并且可能导致更少的细胞应激。此外,在这个阶段,研究人员应该注意细胞要处于一个完全优化的生长条件下生长,否则,它可能导致珍贵细胞样本的死亡和产生 敲除细胞系 的所有工作都被白费了。

对于一些细胞系来说,产生单细胞克隆是棘手的,只有少数克隆可能在分离过程中能茁壮成长。源井生物在克隆分离方面具有丰富的经验,我们会在预实验阶段找出产生单细胞克隆的最佳方法。

当构建好敲除细胞系之后,就需要对特定基因编辑进行充分验证,这是KO实验的最后一步了,也是最令人期待的一步。验证细胞KO是否成功需要对敲除细胞进行表征并确保工作的下游可行性。 有多种方法可以用来验证细胞系的基因是否有被正确编辑。 验证工程细胞系的常用方法包括Sanger测序,新一代测序NGS和qPCR以在基因组水平上验证编辑。蛋白质印迹WB和质谱可以在蛋白质组学水平上确认KO。对于功能研究,经常使用免疫组织化学,免疫细胞化学和FACS。如果你在基因水平,蛋白质水平和功能水平上都得到了预期的结果,那真的要好好恭喜你了! 因为在一般情况下,在蛋白质水平上的验证往往不如人意,但是想发高分文章却常常躲不掉这一步,因此能100%保障WB结果成功是来评价一个细胞敲除服务的关键指标。

源井生物CRISPR-U™敲除细胞株

源井生物开发的CRISPR-U™系统可用于精确的基因组编辑,我们敲除细胞系通过使用qPCR,Sanger测序以及WB在许多情况下均通过了验证, 目前已经有超过5000个基因确认在基因组和蛋白质组水平上的成功敲除。

参考文献:

Generating Single CellCDerived Knockout Clones in Mammalian Cells with CRISPR/Cas9. Curr Protoc Mol Biol. 2019.

其中 依赖DNA Binding Proteins 的技术有:

蛋白特异性结合DNA后,

蓝色是自己设计的20bp的gRNA序列;

而切割位点在NGG的上游某个位置,_-20bp之间。

有两种修复切口的方法:

主要有2个使用方法:

一个载体上2个gRNA的例子。

几乎每种微生物都有自己的Cas9版本,大小和序列都不一样。

切割效率也不一样。体内测试切割效率。