sirna在线设计-siRNA有哪些设计？

发物种,基因名至design@即可

On-line tools for designing RNAi probes Design tool

Reference

-->Ambion siRNA Target Finder Elbashir SM, Harborth J et al.

-->Dharmacon siDesign Reynolds A, Leake D et al.

-->Clontech siRNA designer Elbashir SM, Lendeckel W et al.

-->DEQOR Henschel A, Buchholz F et al. EMBOSS SIRNA Elbashir SM, Harborth J et al. siRNA design Yiu SM, Wong PW et al.

Wang L, Mu FY.

-->IDT siRNA design Parrish S, Fleenor J et al. Elbashir SM, Harborth J et al.

-->Interagon Saetrom P.

-->siRNA at Whitehead Yuan B, Latek R et al. Invitrogen BLOCK-iT(tm)

-->T7 RNAi Oligo Designer Dudek P, Picard D. siDirect Naito Y, Yamada T et al. siSearch Chalk AM, Wahlestedt C et al.

在研究基因功能中,RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。其中shRNA慢病毒载体应用颇广,今天小编告诉大家2种方法可以快速设计构建到慢病毒载体中的shRNA。

1. Sigma网站

Sigma 公司做了一个针对人和小鼠的shRNA 库,而且部分基因的shRNA序列经过验证,因此直接使用Sigma 公司已验证过的RNAi 序列最为方便。

首先打开网址:

,以Fli1为例,直接输入基因名,点击search,出现以下界面:

在Products中找到并点击shRNA选项,然后出现这个界面:

点击“MISSION shRNA Lentiviral Transduction Particles”这一行的PRICING,这时会弹出界面展示针对目的基因的shRNA:

当出现时,恭喜你,这个基因有被sigma验证过,下拉可以找到验证过的shRNA,用来构建慢病毒,简单有效,敲减效率基本上是有保证的。如果没有验证过的shRNA,则根据需要多选择几条shRNA也是一样能筛选到有效的靶点。提示:小编倾向选择CDS区的shRNA,3UTR基本不选,而且选择的每一条shRNA都会在NCBI上做BLAST,确保靶点是特异性的。Blast比对后最终确认选择下面2条FLI1基因的shRNA:

需要特别提醒,如果要构建到慢病毒载体上,合成出去的shRNA引物会根据载体有些不一样,sigma用的是pLKO.1载体,小编常用SBI的pGreenPuro(CMV) 载体,两端的酶切位点是BamHI/EcoRI,设计出去的引物最终是这样的(不同shRNA替换中间红色部分):

Sense: GATCCCCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGTTTTTG

Anti-sense: AATTCAAAAACCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGG

2. Life Technologies网站

Life Technologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件,操作非常方便,而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast,直接可以用的。

首先打开网站:

,在Target Design Options处选中shRNA,以Fli1为例,输入Accession number或Nucleotide sequence,其他条件不变:

下拉到底点击RNAi Design,然后出现推荐的10条靶点序列:

根据Rank评星,选择其中需要的(翠花一般选择4条,不同位置各一条),点击Design shRNA Oligos:

然后在Default Loop Sequence选择合适的序列(翠花用的载体是pGreenPuro,不需要这个序列,就默认了,后面合成引物的时候要去掉的),在Custom Loop Sequence处输入CTCGAG,点击Design:

得到shRNA

提醒:合成出去的引物需要做微调,根据载体的要求,和sigma的设计一样,需要在前后加上酶切位点的,最后大功告成。

以前人们一般应用较长的dsRNA作为基因沉默的工具,但后来发现长链dsRNA特异性较差。它不仅可激活RnaseL,导致非特异性RNA降解,而且还能激活依赖于dsRNA的蛋白激酶R(protein:kinase:R,PKR),PKR可磷酸化翻译起始因子e:IF2并使其失活,从而抑制翻译起始。后来人们发现小于30bp的dsRNA即可有效引起基因沉默,并且不会产生非特异抑制现象,进一步研究表明抑制作用最强的是长21bp、3′端有两个碱基突出的siRNA。

但RNAi技术要求siRNA反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对,单个碱基错配就会大大降低沉默效应,而且siRNA还可以造成与其具同源性的其他基因沉默(也叫交叉沉默),所以在siRNA的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的siRNA只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源。

设计siRNA序列应注意以下几点:①从靶基因转录本(mRNA)起始密码子AUG开始,向下游寻找AA双核苷酸序列,将此双核苷酸序列和其下游相邻19个核苷酸序列作为siRNA序列设计模板,有研究结果显示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效;

②每个基因选择45个siRNA序列,然后运用生物信息学方法进行同源性比较,例如使用BLAST(),剔除与其他基因或EST序列有同源性的序列,选出一个特异性最强的siRNA进行合成;

③尽量不要以mRNA的5′端和3′端非翻译区及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板,因为这些区域有许多调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物),调节蛋白会与RISC竞争结合靶序列,降低siRNA的基因沉默效应。