primer designing tool怎么用-全基因合成方法

你设计的引物是否有用?在做实验之前可以做一个电子PCR

qPCR引物设计+在线验证

方法一:NCBI上-probe

1.之前NCBI上有一个probe选项可以直接设计引物,上面会给出上下游序列。比如搜索小鼠nanog基因,它给出了这样的两条引物:

上游引物:TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT

下游引物:ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT

方法二:Primer3web

参考: Primer3web在线引物设计--2分钟学会步骤极简的引物设计! - 哔哩哔哩 ()

2.1. 寻找基因序列

以human p53为例进行引物设计。

PubMed官网:

第一步:下拉条目选择核苷酸(Nucleotide)

第二步:输入基因+物种+mRNA(例如:p53 human mRNA)

第三步:点击搜索(Search)

第四步:单击选择 左边栏的(mRNA4.782)

第五步:单击进入第一条(Homo sapiens mRNA for P53, complete cds)为我们所寻找的p53 human mRNA

第六步:单击选择Features中的CDS 选项

第七步:单击选择FASTA 格式就会出现这个 基因的CDS系列

2.2.开始设计引物

Primer3web官网:

/

进入Primer3web官网后,执行以下操作:

第一步:下拉条目选择物种(HUMAN)

第二步:在输入框中输入刚刚复制来的CDS序列

第三步:单击获取引物(Pick Primers)

第四步:引物序列输出;在最终结果中,有四对引物供选择。

选择合适的引物:怎样算合适?

首先看看引物的就是扩增长度,100~300bp 间比较好扩增;

引物长度在 20~25bp 较好,而且上下游引物间不要相差超过 5bp;

再就是看看 Tm 值,60℃左右,相差不要超过 1℃。

再加一点:

既然是设计qPCR引物,那么一定要跨外显子设计,这样可以避免基因组DNA的影响CT值,如果没有跨越外显子,则扩增出来的溶解曲线CT值就会偏小。那么怎样知道自己设计出来的引物有没有跨外显子设计呢?

答案是可以根据自己设计的引物所在的基因组位置去和NCBI上该基因的外显子和内含子的连接位置进行对比。直接看那个基因的mRNA的join位置即可。

方法三:NCBI-BLAST-primer-blast

以上引物设计完成后还要自己手动去查找引物是否跨越了内含子,太麻烦了。那么再普及更方便的办法。

参考:

3.1:在NCBI上找到目的基因的mRNA序列

打开NCBI主页面,选GENE,输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属,打开-》显示基因信息,找到“mRNA and protein”前面那个NM***********,号码复制下来。

注意:这个时候会看到有很多条NM****信息,表示这个基因不同的isoform,通过查找文献以及这些基因序列后面的解释来确定。如果不清楚,一般选择最长的那条。

3.2:开始设计跨越外显子的引物

打开NCBI上-BLAST-primer-blast网站,将上面复制的mRNA编号输入序列框中,下拉选项中选择你的物种,然后在Exon junction span下拉框选择Primer must span an exon-exon junction,设置引物长度最小和最大值,然后点击Get primer。就可以跳到Primer-BLAST Results页面。这个过程会有点长,稍微等一下。出来后,里面有个Graphical view of primer pairs那一栏,会告诉设计出来的几对引物分别跨越了哪几个外显子。

在这些跨越外显子的引物对中选择最好的那对:

a).一对引物中只要有一个引物跨越了外显子就可以了。(因为一个引物跨了内含子,这条引物就不会和基因组DNA匹配,就算另外一个引物和基因组DNA匹配了,一条引物是扩不出来东西的。因为一条引物扩增达不到指数增长,扩了几十个循环后,信号就被指数增长的正确匹配的信号给掩盖了。就像在普通PCR中,只加上游或者下游引物,PCR出来绝对是没有东西的。因为产量太低了。)

b). 一对引物之间的距离不要太长,因为扩增产物要求在100-300bp之间比较好,过长会影响CT值变小。

验证自己设计的引物PCR出来什么东西呢?可以做一个电子PCR看看。

1.UCSC-Tools-In-Silico PCR

进入UCSC,选择Tools的In-Silico PCR,输入上下游引物,target选择genome assembly,点击submit,或者如果这样出不来,记得勾选Flip Reverse Primer。因为可能上下游弄反了。提交后顺利的话,会出来一大段序列,上面会告诉你这个电子PCR做完后产出的序列在染色体上的位置及起止长度.然后再NCBI的gene选项输入自己PCR的目的基因,看看目的基因的起始位置,就知道这个PCR出来的是不是目的基因序列了。

注意:OCR产出的序列只可能是目的基因的一部分,对比一下序列起始位置就知道了。因为设计引物时是用目的基因设计的,PCR出来的是两条引物之间的序列。

进入NCBI-BLAST-primerBLAST;或者直接进入这个网址: Primer designing tool ()

在primer parameter输入你刚刚设计的上下游引物

在database下拉选项选择Refseq mRNA

再点击Get primer;

等一会,会卡一会 才出来。

出来了一个Detailed primer reports;上面写了Products on target template都是Homo sapiens tumor protein p53 (TP53)的不同转录本,且出来的产物长度也一样。说明这对引物扩增出来的就是这个基因。

两种验证方法优缺点:

UCSC验证方法可以检验你扩增出来的所有序列;

而NCBI的BLAST只能给出扩增出来的东西是不是你要的基因,以及扩增出来的产物的长度。

选择:建议使用NCBI-BLAST-primer-blast方法设计引物,也用NCBI-BLAST-primer-blast方法验证你设计出来的引物。

【技术分享】qPCR引物设计有妙招 - 知乎 ()

例如:Syt4(mouse)这个基因设计qPCR引物

step1:进入NCBI-GENE,找到这个基因的mRNA的NM*****号

step2:将这个号输入NCBI-BLAST-primer-blast输入序列框中,勾选相应条件;,且限制了PCR产物长度在70-300之间;由此设计出了10条跨内含子的引物,由Tm条件等选出了第二对引物:

上游: GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT

下游: CCAACCGTCCAATCACCTCA

step3:将这对引物重新输入NCBI-BLAST-primer-blast的上下游引物框中,点击Get primers,发现这对引物扩增出来的基因就只有Syt4基因,说明这对引物特异性很好。

step4:进入UCSC-Tools--In-Silico PCR,输入上下游引物,点击提交,即可。如果跳转出来没有产物,则重新返回调整一下参数,比如说target参数,Flip Reverse Primer:是否勾选等。最终产物是Syt4,长度220bp。说明这对引物的PCR产物特异性很高,只有这一个产物。

step5:进一步验证:由于设计引物时跨越了内含子,且已经提醒我是上游引物跨越了内含子,于是我进入NCBI-Nucleotide 输入:Syt4 Mus musculus mRNA,点击搜索,然后点击左边栏目中的mRNA,然后点击第一条........参考以上2.1步骤,寻找这个基因的CDS序列,找到CDS序列后,搜索这两条上下游引物,发现在CDS区域中,且这对引物的PCR产物序列也在CDS区域中,仔细查看发现上游引物所在位置是1203-1224,确实跨越了两个外显子:exon 1098..1218和 exon 1219..3901.

以上我们设计出了Syt4这个基因的qPCR引物序列。可以直接让公司合成了。

以上所讲的都是qPCR的引物设计,一般扩增出来的基因产物都只有100-300bp之间,用于定量或者半定量。但是如果想要扩增全长DNA,则用到Primer5软件。扩增产物的长度可以自己在上面设置。

如何使用Primer Premier 5软件设计PCR引物-百度经验 ()

一直用primer,还有实验室老板自己写的一个软件,感觉诧异都不大,因为基本的要满足的要素都是一样的,最后也都能拿到蛋白,CODEHOP没用过,感觉万变不离其宗。

全基因合成是指在体外利用人工方法合成双链DNA分子的技术。基因合成无需模板,是获取基因的重要手段之一。目前该技术主要应用在克隆一些不易获取模板的基因、自然界不存在的新基因以及异源基因表达上,经常在对基因密码子优化后进行。密码子优化的必要性及方法,已经在前面的文章中介绍,想要回顾的点这里 密码子优化 。

全基因合成技术很成熟,一般的做法是:设计合成相互重叠的单链寡核苷酸,通过重叠延伸PCR法拼接出全长。关于全基因合成方法的资料网上一大堆,单全基因合成的相关专利都上百篇,常见的有重叠延伸PCR(OE-PCR)法[1,7],双不对称PCR(DA-PCR)法[2],聚合酶连反应(PCR)法[3],连接酶链反应(LCR)法[4],热力学平衡由内向外(TBIO)法[5],PCR介导两步(PTDS)法[6]。说实话我并没有仔细研究这些方法,它们叫什么名字不重要,万变不离其宗:PCR,基于一定重叠的短引物通过聚合酶逐渐延伸成长片段。

全基因合成最简单的方法是什么?

当然是让DNA合成公司来合成,我们只需要提供DNA序列信息,他们会合成dsDNA并克隆在通用载体上,一般还提供测序信息,确保合成的正确性。这无疑是最简单、最省事的方法。而且现在全基因合成十分廉价,1bp不到一块钱还带测序的那种。

既然DNA合成公司那么方便,为什么还要自己合成呢?

① 公司合成慢,一般需要1-2周,如果碰到特殊序列比如对大肠杆菌毒性极大的编码序列,那周期就难说了(我做过一个核酸酶,合成公司一个月没搞定,自己合成一周搞定)。

② 不自由,合成公司提供的一般是携带目标基因的重组载体,拿到后还要用酶切切下来,如果基因内部含有酶切位点还需要避开,当然这些一般不是什么大问题,但你确实没得选。

③ 如前所述,全基因合成一般用于异源基因表达,异源表达的对象大多是酶,研究酶的性质可能又需要构建大量突变体。合成公司只提供一个序列,构建突变体还得自己设计引物重新构建,如果自己合成全基因,只需要将包含突变的引物替换掉,就可以同时获得各类突变体,这在构建含大量突变的突变体时,更有优势。

④ 序列需要保密,毕竟自己才最可靠。

总有人喜欢自己动手丰衣足食,本文我要介绍的是自己合成的方法,介绍两种方法:

1 基于“搭桥”PCR的一次拼接法

这种方法依赖于引物间的相互退火,彼此作为模板相互延伸,因此需要的引物总是一正一反。首先把全基因序列打断为短的oligos,一般不大于59bp,因为一般引物合成以59bp为分水岭,超过59bp价格和时间成本都会高很多。oligos靠3'末端互补序列相互退火,形成带有gaps的双链产物,再由DNA聚合酶补齐gaps,形成带有切刻的DNA双链,这种产物经过Taq DNA Ligase链接形成完整的双链产物,依此为模板进行PCR扩增即可得到目标基因,也可以直接使用带有切刻的DNA双链作为模板进行PCR扩增。

2 基于逐渐延伸的step by step法

这种方法仅最后一条引物为反向,其余均为正向,正向引物间具有重叠序列。倒数第一条oligo与倒数第二条oligo靠末端互补序列相互退火,经过第一次PCR循环,双链延长,延长的双链与倒数第三条oligo继续退火、延长,......,依此类推,直至全长序列合成。这种方法理论上一次PCR循环只能延伸一条引物,N条oliogs就至少需要经过N个PCR循环,由于只有一个延伸端,引物设计比方法1简单,而且引物数目不需要必须为偶数。

⒈ 设计PCR引物

可以借助自动设计工具也可以人工设计,借助工具后面会详细介绍。如果人工设计,推荐使用SnapGene(这款软件的强大就不多说了,搞分子生物学应该都知道,网上有很多破解版,没安装的话自己去百度一个吧),将全基因序列复制进去之后,先调出“Preferences”面板,找到“Primer”选项,把3’端最短匹配长度和最低Tm分别设置为10bp和40℃,这样当你添加引物时软件就会自动提醒有没有次级结合位点(如下图)。

因为3’端错配对本文中的全基因合成方法十分不利,如果这两个设置太低实在难以设计出引物,可以适当调高至12bp和45℃,还不行的话只能优化密码子后再重新设计。

引物的长度预设为59bp,重点是重叠区的设计,一般应该根据重叠区的Tm来确定,不同重叠区之间的Tm平衡很重要,一般∆Tm不超过3℃,推荐把Tm设置在55-58℃之间。需要注意的是,针对本文的方法一,引物数目必须是偶数,从序列开头往后一条一条的拉,下一条oligo的起点是上一条的终点-重叠区,上正下反,如果最后为奇数条,要调整最后几条长度,补出一条反向引物。

针对方法二,从序列开头拉一条正向,剩余全部为反向直到末尾,也可以从末尾拉一条反向,剩余为正向直到开头,这种方法不用管引物数目。

⒉ PCR获得全长产物

一般需要两轮PCR。第一轮,加入少量引物,推荐50uL体系中0.5-1pmol/个oligo,10-15个循环,获得全长模板,本轮PCR推荐使用的DNA聚合酶应该同时缺失3’-5’和5’-3’外切酶活性,这两种活性会损伤重叠区的Tm平衡;第二轮,取1uLPCR产物做模板,加入20pmol全长上下游引物,20-25个循环获得目标基因,本轮PCR应使用高保真DNA聚合酶。

⒊ 克隆至表达载体

通过同源重组,酶切链接等方法将目标基因插入载体中,转化大肠杆菌或其他宿主感受态细胞,获取单克隆子。提示:在全基因合成前,一定要针对克隆/表达载体设计好同源臂或者酶切位点,直接加在全基因序列上,否则还要单独设计引物添加同源臂或者酶切位点。

⒋ 测序鉴定

菌体PCR鉴定阳性克隆子并挑选阳性克隆子测序,正确的克隆可用于下游的表达和纯化。

OPTIMIZER

: ,这是一个非常优秀的在线设计工具,集密码子优化和全基因合成于一身,不过他生成的oligo只能是50、55、60等5的整倍(60就很尴尬了),而且它不检查引物条数,最后一条可能形成错配,这可以通过再设计额外的全长引物弥补。不过我现在发现打不开了,不知道是我的网络问题还是网址/服务器出了问题。

DNA Works

[8]:这个工具来源于《Nucleic Acids Research》,论文中的连接失效了,这是我新找到的连接: ,也支持密码子优化,不过我觉得不是太好用,参数太多有点复杂了。

Gene2oligo

[9]:也来源于《Nucleic Acids Research》,它设计的引物之间是没有空隙(gaps)的,论文中的连接也失效了(原来的链接: ),我也没找到新的。

Assembly PCR Oligo Maker

[10]:来源于《Nucleic Acids Research》,论文中的链接为: ,我还是打不开(我都快哭了)。

GeMS

[11]:来源于《Nucleic Acids Research》,这是一个软件套件,功能很多,链接是: ,打不开。

GeneDesign

[12]:来源于《Genome Research》,论文中的链接是: ,但依然打不开,从论文内容看与我的工具比较像,也根据Tm计算重叠区,可惜没办法看到源码。

gene2oligos

: ,这个一定打得开,这是我自己写的工具,包括密码子分析与优化,将基因自动转化为oligos,生成参考实验方案三个功能。生成的oligos,具有统一长度,重叠区具有相同的Tm值,Tm计算公式为:Tm = 64 + 0.41×GC - 528/n,怎么来的参考我的 《PCR引物设计大法》 。生成的oligos可以,一键复制,格式为oligo+序列编号+空格+Tab+序列(5’-3’),可以直接导入SnapGene。

我的程序输出的引物可以被SnapGene识别,菜单栏点击“Primer”工具,点击”Import Primer from a List“选项,选择从剪贴板导入序列,

可以查看个引物是否完全覆盖目标序列,引物的“头尾“是否冲突等等。

以GFP为目标序列测试一下:

①从NCBI上找到GFP的序列,粘贴到文本框中,首先分析密码子偏性;

大肠杆菌的稀有密码子用红色标出,可见GFP原生基因中含有很多稀有密码子,可以先执行密码子优化。

②生成oligos,有两种方式,默认为方法一,如果引物见相似性高,会提示使用方法二。

点击生成oligos按钮后,会弹出总碱基数的统计信息,然后输出oliogs序号及序列,同时生成实验方案按钮和复制按钮,一键复制后可导入SanpGene分析。

③SanpGene分析

完全覆盖了GFP的基因,并且为偶数条引物,引物间的Tm基本一致(由于程序与SnapGene的Tm算法不一致,在SnapGene上只能看到基本一致。

④生成实验方案

体外全基因合成一般一次不超过1000bp,一次性合成太长会增加出错的概率,我推荐按800bp分段,程序会根据你输入的序列长度推荐分段数。

希望这个工具能帮到你完成全基因合成,我还写了辅助载体构建的工具,以后有机会再介绍。

参考文献

[1] Prodromou,C. and Pearl,L. (1992) Recursive PCR: a novel technique for total gene synthesis. Protein Eng., 5, 827C829.

[2] Sandhu,G.S, Aleff,R.A. and Kline,B.C. (1992) Dual asymmetric PCR: one-step construction of synthetic genes. Biotechniques, 12, 14C16.

[3] Stemmer,W.P., Crameri,A., Ha,K.D., Brennan,T.M. and Heyneker,H.L. (1995) Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene, 164, 49C53.

[4] Au,L.C., Yang,F.Y., Yang,W.J., Lo,S.H. and Kao,C.F. (1998) Gene synthesis by a LCR-based approach: high-level production of leptin-L54 using synthetic gene in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 248, 200C203.

[5] Gao,X., Yo,P., Keith,A., Ragan,T.J. and Harris,T.K. (2003) Thermodynamically balanced inside-out (TBIO) PCR-based gene synthesis: a novel method of primer design for high-fidelity assembly of longer gene sequences. Nucleic Acids Res.,31, e143.

[6] Xiong,A.-S., Yao,Q.-H., Peng,R.-H., Li,X., Fan,H.-Q., Cheng,Z.-M. and Li,Y. (2004) A simple, rapid, high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequences. Nucleic Acids Res., 32, e98.

[7] Young,L. and Dong,Q. (2004) Two-step total gene synthesis method. Nucleic Acids Res., 32, e59.

[8] Hoover,D.M. and Lubkowski,J. (2002) DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucleic Acids Res., 30, e43.

[9] Rouillard,J.-M., Lee,W., Truan,G., Gao,X., Zhou,X. and Gulari,E.(2004) Gene2oligo: oligonucleotide design for in vitro gene synthesis. Nucleic Acids Res., 32, W176CW180.

[10] Rydzanicz,R., Zhao,X.S. and Johnson,P.E. (2005) Assembly PCR oligo maker: a tool for designing oligodeoxynucleotides for constructing long DNA molecules for RNA production. Nucleic Acids Res., 33, W521CW525.

[11] Jayaraj,S., Reid,R. and Santi,D.V. (2005) GeMS: an advanced software package for designing synthetic genes. Nucleic Acids Res., 33, 3011C3016.

[12] Richardson,S.M., Wheelan,S.J., Yarrington,R.M. and Boeke,J.D. (2006) GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Res., 16, 550C556.