sgrna在线设计-protocol-使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑（二）

我对之前的所有教程进行了再次详细的总结

CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计(上)

在上一次文章中,我们已经得到了在线工具设计的sgRNA序列,经由简单评估后选择出合适的sgRNA

以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 为案例,根据给出的PTEN sgRNA,完善oligo序列,并再Snapgene软件中匹配出来

使用Snapgene一键生成oligo,Actions--Anneal Oligos

粘贴事先准备好的序列--保存Oligo文件

(1)打开一个pSpCas9质粒--actin--restriction cloning--insert fragment

(2)在Vector选项卡,选择内切酶为BbsI,在insert部分选择上一步中保存好的oligo,最后点击clone,保存DNA文件。

(3)打开插入后的质粒图谱,检查oligo插入情况,无误后可提交上表中的

这里检测所用的引物和平时做PCR检测mRNA表达的引物是不同的,这里的PCR产物必须覆盖基因编辑的位置,且产物要足够长,至少500 bp。在这里我们以P53为例子:

(1)找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列(2000 bp)

(2)将找到的序列复制粘贴到blast中

设置参数

(3)得到结果(小测试,为何得到的引物只有两对,而且似乎有一对还偏离中心很远,请问应该如何设置,使得产物聚集在中心?)

(4)查看引物基本情况,检查无误可提交公司合成

结语:

以上,我们则是完成了sgRNA及引物设计,提交公司合成,拿到之后则可开始正式实验了,感兴趣的同学,可以完成上面的小测试,有问题请在下方留言,拜拜~

接上文,还是这篇文章。但是上篇文章只是简单的介绍了一下CRISPR-Cas9系统,以及它的一些原理和应用介绍。今天还是基于上次的结构来进行补充。会保留上篇文章中的一些关键信息,以帮助理解。

文章结构简单整理如下:

和ZFN,TALEN一样,CRISPR-Cas也是通过激活DSB的模式来达到基因标记的目的。

CRISPR RNA (crRNA) array,编码gRNA,再加上tracrRNA,则可达到定位+编辑的功能

gRNA用于引导,tracrRNA用于结合靶点。所以,人们就把crRNA和tracrRNA合在一起,成为了single-guide RNA,即sgRNA,而通过修改tracrRNA的序列,在理论上可以on-target任何目的靶点。

Cas9 offers several potential advantages over

ZFNs and TALENs

, including the ease of customization, higher targeting efficiency and the ability to facilitate multiplex genome editing. As custom ZFNs are often difficult to engineer, we will primarily compare Cas9 with TALEN.

Cas9只需要重新购买一对oligos 20-nt gRNA即可,可是TALEM却需要重新设计新的TALEN.

WT S. pyogenes Cas9 (SpCas9) is known to make a blunt cut between the 17th and 18th bases in the target sequence (3 bp 5′ of the PAM). Mutating catalytic residues in either the RuvC or the HNH nuclease domain of SpCas9 converts the enzyme into a DNA nicking enzyme. In contrast, TALENs cleave nonspecifically in the 12C24-bp linker between the pair of TALEN monomer-binding sites.

Cas9可以同时对对个目的基因进行编辑,只要联合使用相应的sgRNA即可。

我放英文原文的原因是:要么这里很重要,担心自己的理解不能完全阐明;要么就是,这里不是那么重要,放出来看看就行。

Cas要求唯一的PAM存在3′ of the 20-bp target sequence,每个同源的Cas9有唯一的PAM序列,而这个情况在人类中却不是那么严格,常常每8-12个bp就能找到一个。

另外很重要的就是脱靶效应。

PAM必须紧跟在20-nt对应的靶向基因的下游,结合前面所说,降低脱靶效应也至关重要。

(i) the 5′-NGG PAM for S. pyogenes Cas9 and (ii) the minimization of off-target activity

We provide an online CRISPR Design Tool ( ) that takes a genomic sequence of interest and identifies suitable target sites.

To experimentally assess off-target genomic modifications for each sgRNA, we also provide computationally predicted off-target sites (for a detailed discussion, see Box 1)

为了解决以上不足之处,张老师课题组提供了在线设计sgRNA的工具,并且也提供了关于脱靶位点的计算方法以及增加编辑效率的alternative strategy(using the D10A nickase mutant of Cas9 (Cas9n) along with a pair of sgRNAs)---该部分内容比较多,感兴趣可回原文查看

CRISPR设计工具提供了所需的所有寡核苷酸和引物的序列(i)制备sgRNA结构,(ii)分析目标修饰效率,(iii)评估潜在靶外位点的切割。值得注意的是,由于表达sgRNA的U6 RNA聚合酶III启动子更倾向于将鸟嘌呤(G)核苷酸作为其转录本的第一个碱基,因此在sgRNA的5 '端附加了一个额外的G,而20-nt引导序列并不以G开头(图4 b, c)。在极少数情况下,某些sgRNA可能由于未知的原因而无法工作;因此,我们建议为每个位点设计至少两个sgRNA,并在预期的细胞类型中测试它们的效率。

Isolation of clonal cell lines with specific modifications is often desired. This can be achieved after transfection by isolating single cells through either

FACS (Steps 54C65)

or

serial dilutions (Steps 66C70)

, followed by an expansion period to establish a new clonal cell line. It is worth noting that cell types can vary substantially in their responses to single-cell isolation, and literature specific to the cell type of interest should be consulted.

使用流式分离或者连续稀释法得到单克隆。

(1)SURVEYOR nuclease assay.

(2)Plasmid- or ssODN-mediated HDR.

(3)Detection of indels or HDR by sequencing

感谢师兄DZ

我猜你和我一样,保存的是他们上层网址,然后自己点几次才能进入sgRNA的设计界面。

貌似他们把网址改掉了,或是链接bug了。

你用下面这个链接,可以直接进入sgRNA的设计界面:

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亲测有效