shrna设计网站-siRNA有哪些设计？

简单整理一下:

protocol-使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑(一)

protocol-使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑(二)

因为没看懂又中途跑去看了一波中文

CRISPR-Cas9学习笔记

差不多的时候,在师兄带领下,学习设计了一下sgRNA(讲真,这部分我真是什么都不懂,全靠师兄演示之后再自行补充背景知识)

CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计

此外,还有穿插学习的内容

Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记

FLP-FRT系统--诱导性基因编辑inducible gene editing

设计了sgRNA之后怎么办呢??还是这篇文章

(1)首先是实验设计

详情见:CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计

sgRNA的合成和投递有两种方式:A)PCR;B)单独的sgRNA的表达质粒。

A)PCR扩增的方法

U6:来源于人U6小核启动子,常用小RNA 表达,转录本为shRNA。

将sgRNA放到U6后面,利用U6的启动来扩增sgRNA。

将这部分内容整合到Cas9 expression plasmid pSpCas9(Cas9表达质粒)中,一起共转。

B)sgRNA表达质粒的方法

现在我要用这个方法来举例

找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列(2000 bp)

找到的序列如下:

将上面复制的序列粘贴到blast中

系统反馈说我提交的序列和数据中的某基因很像,问我是不是就用下面这个

。

选和不选我都试过了,选择的话,得到的引物有两对,如下(摘选了其中一个):

如果不选的话

这个很好理解,在编辑片段中加入抗生素抗性基因或者荧光基因后,可通过抗生素筛选或者FACS分离。

测序啦!

感谢师兄DZ

以前人们一般应用较长的dsRNA作为基因沉默的工具,但后来发现长链dsRNA特异性较差。它不仅可激活RnaseL,导致非特异性RNA降解,而且还能激活依赖于dsRNA的蛋白激酶R(protein:kinase:R,PKR),PKR可磷酸化翻译起始因子e:IF2并使其失活,从而抑制翻译起始。后来人们发现小于30bp的dsRNA即可有效引起基因沉默,并且不会产生非特异抑制现象,进一步研究表明抑制作用最强的是长21bp、3′端有两个碱基突出的siRNA。

但RNAi技术要求siRNA反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对,单个碱基错配就会大大降低沉默效应,而且siRNA还可以造成与其具同源性的其他基因沉默(也叫交叉沉默),所以在siRNA的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的siRNA只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源。

设计siRNA序列应注意以下几点:①从靶基因转录本(mRNA)起始密码子AUG开始,向下游寻找AA双核苷酸序列,将此双核苷酸序列和其下游相邻19个核苷酸序列作为siRNA序列设计模板,有研究结果显示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效;

②每个基因选择45个siRNA序列,然后运用生物信息学方法进行同源性比较,例如使用BLAST(),剔除与其他基因或EST序列有同源性的序列,选出一个特异性最强的siRNA进行合成;

③尽量不要以mRNA的5′端和3′端非翻译区及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板,因为这些区域有许多调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物),调节蛋白会与RISC竞争结合靶序列,降低siRNA的基因沉默效应。

摘自找图网

4. 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C,使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。

5. ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头,必须在紧连正义链的上游加一个G。