grna的设计-用cas9基因敲除不同转录本怎么设计grna

我对之前的所有教程进行了再次详细的总结

CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计(上)

在上一次文章中,我们已经得到了在线工具设计的sgRNA序列,经由简单评估后选择出合适的sgRNA

以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 为案例,根据给出的PTEN sgRNA,完善oligo序列,并再Snapgene软件中匹配出来

使用Snapgene一键生成oligo,Actions--Anneal Oligos

粘贴事先准备好的序列--保存Oligo文件

(1)打开一个pSpCas9质粒--actin--restriction cloning--insert fragment

(2)在Vector选项卡,选择内切酶为BbsI,在insert部分选择上一步中保存好的oligo,最后点击clone,保存DNA文件。

(3)打开插入后的质粒图谱,检查oligo插入情况,无误后可提交上表中的

这里检测所用的引物和平时做PCR检测mRNA表达的引物是不同的,这里的PCR产物必须覆盖基因编辑的位置,且产物要足够长,至少500 bp。在这里我们以P53为例子:

(1)找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列(2000 bp)

(2)将找到的序列复制粘贴到blast中

设置参数

(3)得到结果(小测试,为何得到的引物只有两对,而且似乎有一对还偏离中心很远,请问应该如何设置,使得产物聚集在中心?)

(4)查看引物基本情况,检查无误可提交公司合成

结语:

以上,我们则是完成了sgRNA及引物设计,提交公司合成,拿到之后则可开始正式实验了,感兴趣的同学,可以完成上面的小测试,有问题请在下方留言,拜拜~

其中 依赖DNA Binding Proteins 的技术有:

蛋白特异性结合DNA后,

蓝色是自己设计的20bp的gRNA序列;

而切割位点在NGG的上游某个位置,_-20bp之间。

有两种修复切口的方法:

主要有2个使用方法:

一个载体上2个gRNA的例子。

几乎每种微生物都有自己的Cas9版本,大小和序列都不一样。

切割效率也不一样。体内测试切割效率。

这要具体分析,如果这个基因存在可变剪接,那就看这个基因是否有外显子(不为三的整倍数的外显子)是这些转录本里共有的,如果是就可以在这个外显子上设计sgRNA,这样就可以敲除掉这个外显子和其后的外显子(因为移码突变导致的提前翻译终止)。如果没有这样的外显子那就只能在不同的外显子上设计多条sgRNA,然后筛选这几个转录本都敲除成功的细胞系或实验动物就可以了(毕竟应用Cas9技术能够实现多基因敲除)。