ncbi在线设计引物-初初学者请教 怎么设计引物？？？ 最好举个例子， 从ncbi 找 基因 到 用软件（最好是oligo）然后设计引物

利用生信工具进行目的基因的引物设计,使用了NCBI进行筛选与设计引物,使用 idtdna对筛选出的DNA进行检查。本文分享了如何筛选出高质量的基因引物,帮助想通过生信进行引物设计的学生、从业者找出合适的基因,毕竟购买引物也比较烧钱,避免设计出的基因质量偏低。

1.查询目的基因:

备注:这里需要注意的是,要找到合适的目的基因!如果找智人,一般会是NM开头

2.选择其中一个数据连接: ,选择Pick Primers

3.进入:

4.根据一些实验经验调节一些关键参数:

1)Primer Parameters-

PCR product size

:设置为75-300

2)Exon/intron selection-

Exon junction span

:设置必须跨越外显子(Primer must span an exon-exon junction),避免污染

3) Advanced parameters - Primer Parameters:GC建议在40%-60%之间

5.点击Get Primers

6.跳转页面

7.挑选合适的primer pair,其中product length最好是在150附近(不是绝对)

8.注册idtdna进行dna分析,

9.抽取其中一个primer pair

Products on intended target

product length = 146

Forward primer 1 ACAGCAACACAGAAGACCGT 20

Template 604 .................... 623

Reverse primer 1 CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC 21

Template 749 ..................... 729

10.使用idtdna进行筛选

举例:正旋:ACAGCAACACAGAAGACCGT,反旋:CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC

以此使用正旋与反旋填写入sequence,如图使用正旋,点击self-dimer,如果序列结果中,basePairs都小于10,那么这个引物就算比较好的了,不是自旋产生的。

11.接着正反计算,输入正反旋,年级HETERO-DIMER,最后点击CALCULATE,如果序列结果中,basePairs都小于10,那么这个引物就算比较好的了,不是自旋产生的。

你直接可以用NCBI提供的免费设计软件

在最上面的大空格输入你的目标序列,或者直接输入ncbi的基因号也可以。然后到最下面点击“Get Primers"就可以了。等你熟练后,再可以慢慢练习调整那些参数。

至于如何找基因,你到

在最上面的空格输入基因名称 就可以了。

你设计的引物是否有用?在做实验之前可以做一个电子PCR

qPCR引物设计+在线验证

方法一:NCBI上-probe

1.之前NCBI上有一个probe选项可以直接设计引物,上面会给出上下游序列。比如搜索小鼠nanog基因,它给出了这样的两条引物:

上游引物:TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT

下游引物:ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT

方法二:Primer3web

参考: Primer3web在线引物设计--2分钟学会步骤极简的引物设计! - 哔哩哔哩 ()

2.1. 寻找基因序列

以human p53为例进行引物设计。

PubMed官网:

第一步:下拉条目选择核苷酸(Nucleotide)

第二步:输入基因+物种+mRNA(例如:p53 human mRNA)

第三步:点击搜索(Search)

第四步:单击选择 左边栏的(mRNA4.782)

第五步:单击进入第一条(Homo sapiens mRNA for P53, complete cds)为我们所寻找的p53 human mRNA

第六步:单击选择Features中的CDS 选项

第七步:单击选择FASTA 格式就会出现这个 基因的CDS系列

2.2.开始设计引物

Primer3web官网:

/

进入Primer3web官网后,执行以下操作:

第一步:下拉条目选择物种(HUMAN)

第二步:在输入框中输入刚刚复制来的CDS序列

第三步:单击获取引物(Pick Primers)

第四步:引物序列输出;在最终结果中,有四对引物供选择。

选择合适的引物:怎样算合适?

首先看看引物的就是扩增长度,100~300bp 间比较好扩增;

引物长度在 20~25bp 较好,而且上下游引物间不要相差超过 5bp;

再就是看看 Tm 值,60℃左右,相差不要超过 1℃。

再加一点:

既然是设计qPCR引物,那么一定要跨外显子设计,这样可以避免基因组DNA的影响CT值,如果没有跨越外显子,则扩增出来的溶解曲线CT值就会偏小。那么怎样知道自己设计出来的引物有没有跨外显子设计呢?

答案是可以根据自己设计的引物所在的基因组位置去和NCBI上该基因的外显子和内含子的连接位置进行对比。直接看那个基因的mRNA的join位置即可。

方法三:NCBI-BLAST-primer-blast

以上引物设计完成后还要自己手动去查找引物是否跨越了内含子,太麻烦了。那么再普及更方便的办法。

参考:

3.1:在NCBI上找到目的基因的mRNA序列

打开NCBI主页面,选GENE,输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属,打开-》显示基因信息,找到“mRNA and protein”前面那个NM***********,号码复制下来。

注意:这个时候会看到有很多条NM****信息,表示这个基因不同的isoform,通过查找文献以及这些基因序列后面的解释来确定。如果不清楚,一般选择最长的那条。

3.2:开始设计跨越外显子的引物

打开NCBI上-BLAST-primer-blast网站,将上面复制的mRNA编号输入序列框中,下拉选项中选择你的物种,然后在Exon junction span下拉框选择Primer must span an exon-exon junction,设置引物长度最小和最大值,然后点击Get primer。就可以跳到Primer-BLAST Results页面。这个过程会有点长,稍微等一下。出来后,里面有个Graphical view of primer pairs那一栏,会告诉设计出来的几对引物分别跨越了哪几个外显子。

在这些跨越外显子的引物对中选择最好的那对:

a).一对引物中只要有一个引物跨越了外显子就可以了。(因为一个引物跨了内含子,这条引物就不会和基因组DNA匹配,就算另外一个引物和基因组DNA匹配了,一条引物是扩不出来东西的。因为一条引物扩增达不到指数增长,扩了几十个循环后,信号就被指数增长的正确匹配的信号给掩盖了。就像在普通PCR中,只加上游或者下游引物,PCR出来绝对是没有东西的。因为产量太低了。)

b). 一对引物之间的距离不要太长,因为扩增产物要求在100-300bp之间比较好,过长会影响CT值变小。

验证自己设计的引物PCR出来什么东西呢?可以做一个电子PCR看看。

1.UCSC-Tools-In-Silico PCR

进入UCSC,选择Tools的In-Silico PCR,输入上下游引物,target选择genome assembly,点击submit,或者如果这样出不来,记得勾选Flip Reverse Primer。因为可能上下游弄反了。提交后顺利的话,会出来一大段序列,上面会告诉你这个电子PCR做完后产出的序列在染色体上的位置及起止长度.然后再NCBI的gene选项输入自己PCR的目的基因,看看目的基因的起始位置,就知道这个PCR出来的是不是目的基因序列了。

注意:OCR产出的序列只可能是目的基因的一部分,对比一下序列起始位置就知道了。因为设计引物时是用目的基因设计的,PCR出来的是两条引物之间的序列。

进入NCBI-BLAST-primerBLAST;或者直接进入这个网址: Primer designing tool ()

在primer parameter输入你刚刚设计的上下游引物

在database下拉选项选择Refseq mRNA

再点击Get primer;

等一会,会卡一会 才出来。

出来了一个Detailed primer reports;上面写了Products on target template都是Homo sapiens tumor protein p53 (TP53)的不同转录本,且出来的产物长度也一样。说明这对引物扩增出来的就是这个基因。

两种验证方法优缺点:

UCSC验证方法可以检验你扩增出来的所有序列;

而NCBI的BLAST只能给出扩增出来的东西是不是你要的基因,以及扩增出来的产物的长度。

选择:建议使用NCBI-BLAST-primer-blast方法设计引物,也用NCBI-BLAST-primer-blast方法验证你设计出来的引物。

【技术分享】qPCR引物设计有妙招 - 知乎 ()

例如:Syt4(mouse)这个基因设计qPCR引物

step1:进入NCBI-GENE,找到这个基因的mRNA的NM*****号

step2:将这个号输入NCBI-BLAST-primer-blast输入序列框中,勾选相应条件;,且限制了PCR产物长度在70-300之间;由此设计出了10条跨内含子的引物,由Tm条件等选出了第二对引物:

上游: GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT

下游: CCAACCGTCCAATCACCTCA

step3:将这对引物重新输入NCBI-BLAST-primer-blast的上下游引物框中,点击Get primers,发现这对引物扩增出来的基因就只有Syt4基因,说明这对引物特异性很好。

step4:进入UCSC-Tools--In-Silico PCR,输入上下游引物,点击提交,即可。如果跳转出来没有产物,则重新返回调整一下参数,比如说target参数,Flip Reverse Primer:是否勾选等。最终产物是Syt4,长度220bp。说明这对引物的PCR产物特异性很高,只有这一个产物。

step5:进一步验证:由于设计引物时跨越了内含子,且已经提醒我是上游引物跨越了内含子,于是我进入NCBI-Nucleotide 输入:Syt4 Mus musculus mRNA,点击搜索,然后点击左边栏目中的mRNA,然后点击第一条........参考以上2.1步骤,寻找这个基因的CDS序列,找到CDS序列后,搜索这两条上下游引物,发现在CDS区域中,且这对引物的PCR产物序列也在CDS区域中,仔细查看发现上游引物所在位置是1203-1224,确实跨越了两个外显子:exon 1098..1218和 exon 1219..3901.

以上我们设计出了Syt4这个基因的qPCR引物序列。可以直接让公司合成了。

以上所讲的都是qPCR的引物设计,一般扩增出来的基因产物都只有100-300bp之间,用于定量或者半定量。但是如果想要扩增全长DNA,则用到Primer5软件。扩增产物的长度可以自己在上面设置。

如何使用Primer Premier 5软件设计PCR引物-百度经验 ()