引物在线设计软件-求oligo 7软件使用说明或者教程。

引物设计相关软件!

NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件

Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计,非常棒的一个软件。

Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件,主要应用于核酸序列引物分析设计软件。

Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件,专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体,简化引物设计工作。

Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列(microarray)软件,批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。

Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。

NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件,用IE打开运行。

TGGE-STAR DOS软件,PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。

e-PCR 2.3.9 电子克隆是一种电脑软件,用来识别DNA序列标签位点(STSs)。

FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物,还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具;

OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件,可建立寡核苷酸数据库

PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件。

AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件。

AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件。

MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件

ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件

Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。

PCR Analyzer 1.0 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件

在线工具

DNAWorks 3.0 是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序。 程序仅需要输入一些简单的信息,比如,目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列。利用DNAWorks的帮助,用两步PCR法,可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站。

The Primer Generator 在线引物设计程序。

Primer 3 比较有名的在线引物设计程序。

Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件。

Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计软件。

AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 .

一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件,而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。

附上两款软件使用方法!

Primer Premier 5.0 的使用技巧简介

1. 功能

“Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能( ),但并非其特长,在此略过。此外,该软件还有一些特殊功能,其中最重要的是设计简并引物,另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换( )、语音提示键盘输入( )等等。

有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物,由于大多数氨基酸(20 种常见结构氨基酸中的18 种)的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列时,会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物,它们的序列组成大部分相同,但在某些位点有所变化,称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择,有纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear)、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochondrion)、支原体(Mycoplasma)、植物线粒体(Plant Mitochondrion)、原生动物线粒体(Protozoan Mitochondrion)、一般标准(Standard)、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondrion)和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion)。

2. 使用步骤及技巧

“Premier”软件启动界面如下:

(转载的时候就没有图)

其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述)。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元(如-10 序列,-35 序列等),按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。

进行引物设计时,点击按钮,界面如下:

进一步点击按钮,出现“search criteria”窗口,有多种参数可以调整。搜索目的(Seach For)有三种选项,PCR 引物(PCR Primers),测序引物(Sequencing Primers),杂交****(Hybridization Probes)。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物(Sense/Anti-sense Primer,或Both),或者成对查找(Pairs),或者分别以适合上、下游引物为主(Compatible with Sense/Anti-sense Primer)。另外还可改变选择区域(Search Ranges),引物长度(Primer Length),选择方式(Search Mode),参数选择(Search Parameters)等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求,建议使用默认设置。然

后按,随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时,再按,这时搜索结果以表格的形式出现,有三种显示方式,上游引物(Sense),下游引物(Anti-sense),成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式,并按优劣次序(Rating)排列,满分为100,即各指标基本都能达标(如下图)。

点击其中一对引物,如第1#引物,并把上述窗口挪开或退出,显示“Peimer Premier”主窗口,如图所示:

该图分三部分,最上面是图示PCR 模板及产物位置,中间是所选的上下游引物的一些性质,最下面是四种重要指标的分析,包括发夹结构(Hairpin),二聚体(Dimer),错误引发情况(False Priming),及上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer)。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时,按钮由变成,点击该按钮,在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构,因此最好的情况是最下面的分析栏没有,只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度,可参考应用。

在需要对引物进行修饰编辑时,如在5’端加入酶切位点,可点击,然后修改引物序列。若要回到搜索结果中,则点击按钮。如果要设计简并引物,只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则,反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之,“Premier”有优秀的引物自动搜索功能,同时可进行部分指标的分析,而且容易 使用,是一个相当不错的软件。

Oligo 6.22 使用技巧简介

1. 功能

在专门的引物设计软件中,“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂,但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图:Tm 图和ΔG 图;Oligo 6.22 的界面更复杂,出现三个图,加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。

2. 使用(以Oligo 6.22 为例)

Oligo 6.22 的启动界面如下:

图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq,其中Frq 是6.22 版本的新功能,为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade 排列方式不太方便,可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,这样界面的结构同于Oligo5.0,只是显示更清楚了。

经过Windows/Tili 项后的显示如图:

在设计时,可依据图上三种指标的信息选取序列,如果觉得合适,可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮,选好上游引物,此时该按钮变成,表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上,只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高,而在3’端相对低(如图:)

Tm 值曲线以选取72℃附近为佳,5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时,宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。

当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成(cross dimer)。二聚体形成的能值越高,越不符合要求。一般的检测(非克隆)性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。一般来说,这两项结构的能值以不超过4.5 为好。

当然,在设计克隆目的的PCR 引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量,以45-55%为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近,以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA,而是一个特定模板序列,那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查

可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高,就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好,但对于特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为450 以上,而在错误位点的引发效率为130,那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测,按Alt+P 键弹出PCR 窗口,其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数,最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似,并且似乎并不比后者更好用,在此不再赘述。其实,使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物,如果参数设置得当将大大提高工作效率。

除了本地引物设计软件之外,现在还有一些网上引物设计软件,如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等(本网站

http://210.72.11.60/

已引进并调试好该软件,欢迎使用)。该软件的独特之处在于,对全基因组PCR 的引物设计;可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对,发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区.同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构.如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它.如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物.

现在可以在这一保守区域里设计一对引物.一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对.

让我们先看看P1引物.一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%.而且四种碱基的分布最好随机.不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在.否则P1引物设计的就不合理.应重新寻找区域设计引物.

同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补.

引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大.但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的.这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率.

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则:

① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性.

② 产物不能形成二级结构.

③ 引物长度一般在15~30碱基之间.

④ G+C含量在40%~60%之间.

⑤ 碱基要随机分布.

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补.

⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补.

⑧ 引物5′端可以修饰.

⑨ 引物3′端不可修饰.

⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位.

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计.

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源.

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域.用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板.实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的.

3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer.引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性.

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%.其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳.

5.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发.

6.引物自身

引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性.这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp.

7.引物之间

两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性.

8.引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰.3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配.

在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的.A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100.引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的.

9.引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大.因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等.

10.密码子的简并

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率.

特殊目的的引物设计将在有关章节讨论.随着人们对引物的认识,一些引物的计算机设计程序也应运而生,下面将讨论有关引物计算机设计方法.

现有的引物设计软件有primer5.0比较好.

Oligo使用方法介绍

作为目前最好、最专业的引物设计软件,Oligo的功能很强,在这里我们介绍它的一些主要功能:如:普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。

在正式进行引物设计前,我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列,根据不同的实验情况,导入模板有三种方法:

1, 直接用键盘输入:

a, 点击file菜单中的New Sequence 浮动命令,或直接点击工具栏中的New Sequence命令,进入序列展示窗口;

b, 此时即可键入DNA序列;

c, 如果需要的话,Oligo提供碱基回放功能,在边键入时边读出碱基,防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。

2, 利用复制和粘贴:当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式,如word文件.html格式,这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴,oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后,点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令,即可进入引物设计模式。

3, 如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA,GenBank格式时,oligo就可以直接打开序列文件。

点击File菜单中的“Open”浮动命令,找到所需文件,打开即可。

进入引物设计模式后,oligo一般会弹出三个窗口,分别是6-碱基频率窗口,碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口,其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口,其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用,比如6-碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率,如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时,该信息就显得有用了,而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。

一,普通引物对的搜索:

以Mouse 4E(cDNA序列)为例。我们的目的是以Mouse 4E(2361 bp)为模板,设计一对引物来扩增出600-800bp长的PCR产物。

1,点击“Search“菜单中的”For Primers and Probes“命令,进入引物搜索对话框;

2,由于我们要设计的是一对PCR引物,因此正、负链的复选框都要选上,同时选上Compatible pairs。

在Oligo默认的状态下,对此引物对的要求有:a,无二聚体;b,3’端高度特异,GC含量有限定,d,去除错误引发引物等。

3,剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。

①单击:“search Ranges”按钮,弹出“Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围:1-2000,下游引物的位置:100-2300;PCR产物的长度600-800bp。

②单击“Paramaters”按钮进入“Search Parameters”对话框,对话框种分三个活页,分别是:不同设定,参数以及更多参数。

③在“普通设定”窗口,为我们提供了对引物非常直观的设定方法,从高到低分六个等级,最后还有一个用户定制选项。

④当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时,就可以直接设定Very high/High等来完成对引物设计参数的设定。

⑤当我们选中“Automatically Change String”后,Oligo会在引物搜索过程中:如果在高等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索,知道找到引物对。在设计反向PCR引物对时,就选中“Inverse PCR”复选框。

⑥我们还可以让引物的长度可以改变,以适应设定的Tm值或PE?(Prime Effitions,引发效率)。也可以限定所选引物对的最大数目。

⑦在“Parameters”窗口中,实际上需要我们改动的只有引物的长度,根据试验的要求作相应的改变,如23nt。其他参数就使用Oligo的默认值,一般无需改变。在“More Parameters“窗口中,一般也无需作任何改变,直接用Oligo的默认值。

4,点击“确认”-“Ok”进入搜索窗口,再次单击“OK”后,Oligo自动完成引物对的搜索,并出现一个搜索结果窗口。显示出得到的引物对数目。

5,点击“Ok”,出现“PrimerPairs”窗口,在窗口中列出了7对引物的简单信息,引物位置,产物长度,最佳退火温度及GC含量。单击“Sort”按钮,可以按产物长度,最佳退火温度及GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。

6,点击任意一对引物,在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口,在窗口中我们可以看到这对引物在模板中的大概位置,最佳退火温度(该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二步退火)。另外还有引物的Tm值,GC含量,引发效率,同时还计算出了产物的Tm值于引物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。一般我们尽量保持前者在20度以内,后者在5-6度以内。点击不同的引物对时,PCR窗口内容同时作相应的改变。

7,要想了解引物的详细信息,如二聚体,发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位点等,这时只需点击“Analyze”菜单中的相应命令,就可以分别得到相关信息。例如点击“Duplex Formation”,我们就可以得到上游引物间,下游引物间及上下游引物间形成二聚体的情况。同理,“Hairpin Formation”,“Composition and Tm”,“False Priming Sites”等命令就可以显示出相关信息。所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选择最佳的引物对。

需要说明的是,1,如果一次搜索得到的引物对太多时,我们可以适当提高选定的条件和规定更合适的搜索范围来减少引物对数;2,引物一般尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体,同时二聚体的自有能绝对值尽量小于10;3,对于错误引发,在普通PCR中,如果引发效率在160 points以上时,就可能出现杂带,在测序反应中,错误引发效率则应该严格控制在120 points以下。

8,Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件:

首先点击“File”菜单中的“Print/Save Options”,在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”;在“Analyze I”中选择需要保存的信息,在“Analyze II”中选中PCR。

单击确定按钮退出,这时再次点击“File”菜单,Save浮动命令中的“Data Save as”,选择路径及文件名即可。

二,测序引物的设计:

在oligo中,测序引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。

还是以Mouse 4E为例,假如我们要在600-800bp的位置设计一条测序引物。

Open-Search

在“Search”窗口中,选中“Sequece Primer”,同时去除负链Search的选中

在“Search Range”窗口,输入正链的600-800bp

在“Parameters”中选定 very high ,引物长度改为18bp

结果得到11条测序引物,与普通引物同理,根据其详细信息就可以挑选到一条最佳的测序引物。

三,探针的设计:

探针的设计与测序引物设计基本相同,只需使“Search”窗口的探针设计选中,改变探针的长度就可以。

四,评估引物对:

我们在各种文献中查到的引物,如果直接进行PCR,往往很难重复别人的实验结果。这时就想到,是不是引物的质量有问题?能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢?答案时肯定的。

1,点击File菜单中的New命令;

2,在“Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物;

3,如果该引物的首位置不是1的话,可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字,如20;

4,点击Accept/Discard菜单的Accept命令;

5,如果引物序列长度不同于当前的引物的话,可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度;

6,选取当前序列为上游引物(点击“upper”按钮);

7,从Edit菜单中选取“Lower Primer”命令,在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列;

8,在Edit窗口的上角处,输入相应的5’位置;

9,选取“Accept and Quit”命令;

如果想让程序给出最佳退火温度,在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比,一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44%。

10,点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。

心得

yvette wrote:

对于作PCR的来说,最难的莫过于设计引物了,理论现在已经很多了,但是真正实践起来是要付出一定的心智的,记得曾经看到某一位主任说他设计了上千对引物,从没有失手的时候,真是让我佩服得五体投地。

最近看了一下OLIGO6.0的使用说明,英文的,感觉有很多地方还是讲得不很明白,比如 Nested primers design 及 multiplex PCR Primer design.

下面我先来讲讲普通的利用OLIGO 设计引物的方法吧:

1 从文件菜单打开模板序列,当然,不是随便什么序列都可以打开的,要有特定的格式,一般扩展名为 *.seq的序列可以直接打开,或者就从文件菜单选择new sequence打开一个空窗口,然后利用复制/粘贴也可以导入模板序列,或者直接在该窗口中写,然后要打开文件菜单旁边的 accept 菜单,选accept就可以了;这时候有三个窗口,重叠在一起,很不方便看,可以从window菜单选Tile,这样,三个窗口就平行排列了。

2 从search菜单选primers and probes,打开了引物搜索窗

3 点黑PCR下面的compatible pairs 前面的小圆孔

4 在oligonucleotide with GC clamp 及 Eliminate false priming 前的小方格里打上勾

5 如果在PCR中可能存在其他的模板,要想使所设计的引物与该模板不会形成错配,可在 And continue above search in other files 的条目前方格中打勾,这时会出现一个新的 select files窗,导入可能会形成错配的模板序列。点OK

6 点Search ranges按钮,输入你想要的上游和下游引物在模板序列上的区间及想要的产物的长度,点OK

7 点parameters 即引物参数按钮,一般将搜索严谨性设为high,如果搜不到,再降低严谨性,另外,在adjust length to match Tm's前的方格中打勾。点OK

8 点击OK开始自动搜索

9 搜索完成后,在search status窗口的下部选show:primer primers, 点OK

10 得到的引物可以根据位置、长度、退火温度及GC含量进行排序(sort)

11 点击您所想要的就打开了一个窗口显示引物的位置、退货温度、GC含量、PE(Priming efficiency 引发效率)等。

12 从文件菜单点击"New Database" ,然后从import菜单点击 upper primer 和lower primer 就可以将您所需要的上下游引物序列导入到数据库中,至于如何生成引物报告单我就不甚了了,感觉这个功能不如primer premier好使。还希望知道如何使用的兄弟不吝赐教一下叻。

Nested Primer pairs Search

与上述自动搜索差不多,有一下几点不同:

1 打开search菜单后,不要选定 “ And continue above search in other files ”

2 打开parameters菜单后,注意不要选定“ Inverse PCR” 框 ,同样选定“adjust length to match Tm's” 框

3 开始搜索后得到结果显示在“Primer pairs"窗口中,从analyze菜单中 选定multiplexing,得到一个显示所有搜索到的引物在模板上的位置的窗口,直接在该窗口中选择您所要的引物,在您所要的引物的小方块上点击一下,positive strand primer 选定后就从红色变成了绿色,negative strand primer 选定后就从蓝色变成了绿色。先选择巢式PCR的一对外引物,然后选择一对内引物,选定后点击pairs就打开了显示您所选定引物的窗口

4 从文件菜单点击"New Database" ,然后从import菜单点击multiplexed primers就将您所选定的引物导入到一个数据库中,保存。

好像从export 菜单可以生成order form, 但是我实在是太木了,这都大功告成了,到了最后又歇菜了。

还有很重要的功能如搜寻 consensus primer pair 和搜寻 unique primer pair 来扩增同源性的模板,比如后一个应该就是设计扩增许多同源性很高的序列的保守区吧,我以为我已经找到了尚方宝剑了,可是三条序列试了一下,这三条序列经过 multiple align后有很长一段是保守的,您猜怎么着,等了好几分钟,结果没有找到,我又用十条序列,干脆就死机了,可能这一功能需要很大的内存才能使用。也许是我还没有找到窍门,有知道的还请教教我。