sirna设计软件-siRNA实验方法和设计常见问题解答

在研究基因功能中,RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。其中shRNA慢病毒载体应用颇广,今天小编告诉大家2种方法可以快速设计构建到慢病毒载体中的shRNA。

1. Sigma网站

Sigma 公司做了一个针对人和小鼠的shRNA 库,而且部分基因的shRNA序列经过验证,因此直接使用Sigma 公司已验证过的RNAi 序列最为方便。

首先打开网址:

,以Fli1为例,直接输入基因名,点击search,出现以下界面:

在Products中找到并点击shRNA选项,然后出现这个界面:

点击“MISSION shRNA Lentiviral Transduction Particles”这一行的PRICING,这时会弹出界面展示针对目的基因的shRNA:

当出现时,恭喜你,这个基因有被sigma验证过,下拉可以找到验证过的shRNA,用来构建慢病毒,简单有效,敲减效率基本上是有保证的。如果没有验证过的shRNA,则根据需要多选择几条shRNA也是一样能筛选到有效的靶点。提示:小编倾向选择CDS区的shRNA,3UTR基本不选,而且选择的每一条shRNA都会在NCBI上做BLAST,确保靶点是特异性的。Blast比对后最终确认选择下面2条FLI1基因的shRNA:

需要特别提醒,如果要构建到慢病毒载体上,合成出去的shRNA引物会根据载体有些不一样,sigma用的是pLKO.1载体,小编常用SBI的pGreenPuro(CMV) 载体,两端的酶切位点是BamHI/EcoRI,设计出去的引物最终是这样的(不同shRNA替换中间红色部分):

Sense: GATCCCCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGTTTTTG

Anti-sense: AATTCAAAAACCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGG

2. Life Technologies网站

Life Technologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件,操作非常方便,而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast,直接可以用的。

首先打开网站:

,在Target Design Options处选中shRNA,以Fli1为例,输入Accession number或Nucleotide sequence,其他条件不变:

下拉到底点击RNAi Design,然后出现推荐的10条靶点序列:

根据Rank评星,选择其中需要的(翠花一般选择4条,不同位置各一条),点击Design shRNA Oligos:

然后在Default Loop Sequence选择合适的序列(翠花用的载体是pGreenPuro,不需要这个序列,就默认了,后面合成引物的时候要去掉的),在Custom Loop Sequence处输入CTCGAG,点击Design:

得到shRNA

提醒:合成出去的引物需要做微调,根据载体的要求,和sigma的设计一样,需要在前后加上酶切位点的,最后大功告成。

看你自己设计时候的选项。如果选的是发夹结构,虽然是单链,但是自己会形成发夹双链结构,如果是很短的(20bp),则是单链

Q:如何选择转染方法和转染试剂?

A:我们的siRNA适用于各种转染方法。转染方法和转染试剂的选择,需要根据细胞来选择,对于容易转染的细胞,常用的转染方法是脂质体转染。

Q:对于难转染的细胞,应该如何提高其转染效率?转染效率又该如何确定?

A:1)对于贴壁细胞,推荐采用转染试剂转染即可;2)对于难转染的细胞的转染,如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法,但是由于电转的方法对细胞损伤比较大,该方法也未必是最佳的。

转染效率的确定,常用的是使用荧光标记的siRNA,通过荧光显微镜,共聚焦显微镜,流式细胞仪检测的方法。具体可以参考我们的产品说明书。

Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关?

A:转染效率的高低取决于与细胞自身及转染方法,而于siRNA的序列并没有直接关系。因此,siRNA在不同的细胞转染效率可能不一样。

Q:转染siRNA时候的细胞密度多少为宜?

A:依不同的转染方法或转染试剂而定。如使用lipofectamine 2000作为转染试剂,单独转染siRNA,30%～50%密度较佳;而siRNA与质粒共转染,密度可以到80%-90%。

Q:siRNA转染时的培养基要求,可否含血清?

A:不同的转染试剂可能有不同的要求,对于lipofectamine 2000,在配制siRNA和lipofectamine 2000混合物时不能含有血清,但细胞培养基可以含有血清,但不能含有抗生素。

Q:siRNA的储存液体浓度和工作浓度有何区别?

A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度,锐博推荐的贮存液浓度为20 μM;而siRNA的工作浓度就是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度,一般10～100 nM范围内,锐博生物推荐的转染浓度是50nM。

Q:转染时该如何分组?分组的目的是什么?

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Q:为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要?

A:阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说,当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时,您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。

Q:阳性对照及其阴性对照在RNAi实验中的作用?如何选择?

A:阳性对照指的是已经验证的针对看家基因或报告基因有效的siRNA,用于监测实验体系和实验方法的可行性。我们可以提供的阳性对照siRNA有针对GAPDH,ACTB,GFP/EGFP有效的siRNA作为阳性对照,客户可以根据具体的实验需要选择。阴性对照往往是非特异的siRNA,主要用于说明siRNA作用的特异性。阴性对照的选择可以是通用的序列(universal)或是随机打乱的序列(scramble),客户可以根据实验要求选择。

Q:用荧光对照siRNA如何检测转染效率?是不是每次实验都必须做?

A:我们提供的转染对照siRNA带有Cy3或Cy5荧光标记,可以通过荧光显微镜,共聚焦显微镜,流式细胞仪等荧光检测仪器检测。 除此之外,还应该通过阳性对照实验进一步确定。转染效率的高低主要与细胞自身相关,同等实验条件下,每次转染细胞转染效率应该是相近的,因此可以不必每次都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组,将会更加便于排除一些实验问题。

Q:siRNA荧光染料的最大吸收率和发射率各在哪个波段?

A:FAM在495nm处有最大吸收率,在520nm处有最大发射率。

Cy3在550nm处有最大吸收率,在565nm处有最大发射率。

Cy5在643nm处有最大吸收率,在667nm处有最大发射率。

Q:转染后出现细胞死亡是什么原因?如何优化转染条件?

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Q:到了转染时间发现细胞密度太低,该如时转染还是让细胞多长一天再转染?

A:细胞生长需要一定的密度,而转染试剂对细胞有一定的毒性,如果转染时细胞密度过低,细胞可能会因此生长异常甚至死亡。转染前要求良好的细胞状态和细胞活性,一般也不建议用生长几天的细胞做转染。

Q:siRNA的作用效果应该如何检测?

A:通常可以从三个方面来相互验证siRNA的作用效果

3)根据目的基因的功能,从细胞表型的水平检测。

Q:siRNA在细胞内可以作用多长时间?什么时候才是最好的检测时间?

A:siRNA介导的RNAi属于瞬时现象,不能稳定传代,一般其作用时间不可能维持很长时间,通常建议在转染后3 4天内完成检测。最佳检测时间,因细胞、目的基因而异,多在转染后24 48小时之间检测。

Q:为什么要强调mRNA水平检测?可以直接检测蛋白和功能吗?

A:siRNA直接作用于mRNA,因此mRNA水平检测是最直接在指标。

很多客户认为,mRNA的降解直接的结果应该是对应蛋白质含量的下降,因此蛋白水平的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上,很多情况下往往出现,mRNA下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有:

Q:干扰效率多高才是好的靶点?

A:没有明确的界定,干扰效率高低因不同的细胞类型和不同的基因而异。不同细胞类型的转染效率也不尽相同,不同基因的表达水平也相差较大,主要看干扰效果而定。

Q:沉默效果不理想,应该如何处理?

A:最常见的影响沉默效果的两个原因是:转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系,并发现沉默效果不佳,我们建议您对转染效率进行检测,并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在,我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术,这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求,可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。

Q:siRNA反而使得目的基因表达上调了,这是什么原因?该怎么解决?

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Q:我从阴性对照实验中得到和特异性RNAi相同的结果,这说明了什么?

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Q:各组阴性对照的检测结果是否应该一样?如果偏差很大该怎么办?

A:正常情况下,各组阴性对照的检测结果应该是相近的。如果偏差过大,只需考虑实验结果的准确性。另外,对于一些特定的基因,比如与细胞难受压力相关的基因,又如参与细胞免疫的基因,可能会对外界压力比较敏感,使得各组对照的基因表达发生变化不一致。

Q:用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率,我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗?

A:当干扰效率不佳时,可以在一定范围内适当优化转染浓度,通常优化的范围是10~150nM,但不宜过大,高浓度的siRNA将可能增加非特异性作用的可能性并对细胞产生毒性。

Q:同样的siRNA,为什么在细胞A很有效,在细胞B则没有效果?

A:不同细胞的转染效率不一样、基因表达水平也不一样,这些都与siRNA的作用效率有关

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