sirna构建-在进行siRNA实验时为何多采用构建siRNA表达质粒的方法

构建植物siRNA表达载体:设计编码产生小分子发卡RNA(hairpin:RNA,hpRNA)的DNA序列,编码hpRNA的DNA各链反向互补,中间加上7个碱基的间隙,将其连接到农杆菌双元载体质粒上,构建植物表达载体。

多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子(polⅢ)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short:hairpin:RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA:polⅢ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的polⅢ启动子下游。

由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究――带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数周甚至更久。

病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。最适用于已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默,不适用于筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。

因为siRNA只有21个bp左右的小片段,既不随细胞增殖而增殖,又容易降解,只能检测它的瞬时效应,而表达质粒相对稳定一些.

如果要检测稳定的干扰,甚至可以采用病毒,它能随细胞增殖而增殖哦!可以维持至少十代.

因为siRNA只有21个bp左右的小片段,既不随细胞增殖而增殖,又容易降解,只能检测它的瞬时效应,而表达质粒相对稳定一些。

如果要检测稳定的干扰,甚至可以采用病毒,它能随细胞增殖而增殖哦!可以维持至少十代。