在线引物设计软件-为什么在线引物设计软件设计的引物在目标基因内找不到对应序列

引物设计相关软件!

NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件

Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计,非常棒的一个软件。

Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件,主要应用于核酸序列引物分析设计软件。

Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件,专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体,简化引物设计工作。

Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列(microarray)软件,批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。

Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。

NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件,用IE打开运行。

TGGE-STAR DOS软件,PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。

e-PCR 2.3.9 电子克隆是一种电脑软件,用来识别DNA序列标签位点(STSs)。

FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物,还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具;

OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件,可建立寡核苷酸数据库

PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件。

AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件。

AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件。

MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件

ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件

Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。

PCR Analyzer 1.0 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件

在线工具

DNAWorks 3.0 是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序。 程序仅需要输入一些简单的信息,比如,目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列。利用DNAWorks的帮助,用两步PCR法,可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站。

The Primer Generator 在线引物设计程序。

Primer 3 比较有名的在线引物设计程序。

Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件。

Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计软件。

AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 .

一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件,而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。

附上两款软件使用方法!

Primer Premier 5.0 的使用技巧简介

1. 功能

“Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能( ),但并非其特长,在此略过。此外,该软件还有一些特殊功能,其中最重要的是设计简并引物,另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换( )、语音提示键盘输入( )等等。

有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物,由于大多数氨基酸(20 种常见结构氨基酸中的18 种)的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列时,会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物,它们的序列组成大部分相同,但在某些位点有所变化,称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择,有纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear)、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochondrion)、支原体(Mycoplasma)、植物线粒体(Plant Mitochondrion)、原生动物线粒体(Protozoan Mitochondrion)、一般标准(Standard)、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondrion)和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion)。

2. 使用步骤及技巧

“Premier”软件启动界面如下:

(转载的时候就没有图)

其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述)。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元(如-10 序列,-35 序列等),按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。

进行引物设计时,点击按钮,界面如下:

进一步点击按钮,出现“search criteria”窗口,有多种参数可以调整。搜索目的(Seach For)有三种选项,PCR 引物(PCR Primers),测序引物(Sequencing Primers),杂交****(Hybridization Probes)。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物(Sense/Anti-sense Primer,或Both),或者成对查找(Pairs),或者分别以适合上、下游引物为主(Compatible with Sense/Anti-sense Primer)。另外还可改变选择区域(Search Ranges),引物长度(Primer Length),选择方式(Search Mode),参数选择(Search Parameters)等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求,建议使用默认设置。然

后按,随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时,再按,这时搜索结果以表格的形式出现,有三种显示方式,上游引物(Sense),下游引物(Anti-sense),成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式,并按优劣次序(Rating)排列,满分为100,即各指标基本都能达标(如下图)。

点击其中一对引物,如第1#引物,并把上述窗口挪开或退出,显示“Peimer Premier”主窗口,如图所示:

该图分三部分,最上面是图示PCR 模板及产物位置,中间是所选的上下游引物的一些性质,最下面是四种重要指标的分析,包括发夹结构(Hairpin),二聚体(Dimer),错误引发情况(False Priming),及上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer)。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时,按钮由变成,点击该按钮,在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构,因此最好的情况是最下面的分析栏没有,只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度,可参考应用。

在需要对引物进行修饰编辑时,如在5’端加入酶切位点,可点击,然后修改引物序列。若要回到搜索结果中,则点击按钮。如果要设计简并引物,只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则,反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之,“Premier”有优秀的引物自动搜索功能,同时可进行部分指标的分析,而且容易 使用,是一个相当不错的软件。

Oligo 6.22 使用技巧简介

1. 功能

在专门的引物设计软件中,“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂,但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图:Tm 图和ΔG 图;Oligo 6.22 的界面更复杂,出现三个图,加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。

2. 使用(以Oligo 6.22 为例)

Oligo 6.22 的启动界面如下:

图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq,其中Frq 是6.22 版本的新功能,为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade 排列方式不太方便,可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,这样界面的结构同于Oligo5.0,只是显示更清楚了。

经过Windows/Tili 项后的显示如图:

在设计时,可依据图上三种指标的信息选取序列,如果觉得合适,可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮,选好上游引物,此时该按钮变成,表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上,只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高,而在3’端相对低(如图:)

Tm 值曲线以选取72℃附近为佳,5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时,宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。

当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成(cross dimer)。二聚体形成的能值越高,越不符合要求。一般的检测(非克隆)性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。一般来说,这两项结构的能值以不超过4.5 为好。

当然,在设计克隆目的的PCR 引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量,以45-55%为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近,以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA,而是一个特定模板序列,那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查

可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高,就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好,但对于特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为450 以上,而在错误位点的引发效率为130,那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测,按Alt+P 键弹出PCR 窗口,其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数,最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似,并且似乎并不比后者更好用,在此不再赘述。其实,使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物,如果参数设置得当将大大提高工作效率。

除了本地引物设计软件之外,现在还有一些网上引物设计软件,如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等(本网站

http://210.72.11.60/

已引进并调试好该软件,欢迎使用)。该软件的独特之处在于,对全基因组PCR 的引物设计;可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对,发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。

一般对于已知序列的PCR当然不要从保守序列来设计引物,只要从开放可读框前后开始设计就行了.需要从保守序列设计引物的情况一般是两种,一是某个物种里面某个特定基因序列从未被分离过,但其进化关系相近的物种有分离出这个基因的同源基因,这样我们可以调取这些同源基因,对比查看它们的保守序列设计引物,然后就利用这对引物就可以获得这个物种的这个基因的部分序列.然后再设计RACE获得全长序列.另外一种情况则是设计通用引物,很多情况下我们并不需要知道某些基因的全部信息,只要知道他有没有,这种时候就可以根据保守序列设计通用引物.这样的引物可以跨越很多物种获取同一个基因的信息,而不需要根据某特异的物种额外设计多种引物.(搬运过来的,希望对你有帮助)

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区.同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构.如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它.如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物.

现在可以在这一保守区域里设计一对引物.一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对.

让我们先看看P1引物.一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%.而且四种碱基的分布最好随机.不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在.否则P1引物设计的就不合理.应重新寻找区域设计引物.

同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补.

引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大.但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的.这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率.

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则:

① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性.

② 产物不能形成二级结构.

③ 引物长度一般在15~30碱基之间.

④ G+C含量在40%~60%之间.

⑤ 碱基要随机分布.

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补.

⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补.

⑧ 引物5′端可以修饰.

⑨ 引物3′端不可修饰.

⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位.

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计.

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源.

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域.用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板.实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的.

3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer.引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性.

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%.其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳.

5.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发.

6.引物自身

引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性.这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp.

7.引物之间

两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性.

8.引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰.3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配.

在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的.A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100.引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的.

9.引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大.因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等.

10.密码子的简并

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率.

特殊目的的引物设计将在有关章节讨论.随着人们对引物的认识,一些引物的计算机设计程序也应运而生,下面将讨论有关引物计算机设计方法.

现有的引物设计软件有primer5.0比较好.